高毒力肺炎克雷伯菌实验室检测专家共识
肺炎克雷伯菌是医院和社区获得性感染中最常见且最重要的病原菌之一，常导致严重的系统性和多器官侵袭性感染［1］。目前依据其毒力和黏液表型等特性可分为经典肺炎克雷伯菌（classical K. pneumoniae，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent K. pneumoniae，hvKP）。过去广泛流行的是院内感染中占主导地位的cKP，但近30年全球范围内，hvKP感染的发生率一直在不断上升，已引起临床关注，尤其是耐药hvKP逐渐增多，更加引起临床的高度警惕，成为了全球公共卫生领域的重大挑战［2, 3］。而是否需要开展hvKP的实验室检测，以及如何规范hvKP检测方法和鉴定流程就成为了防控hvKP感染亟须解决的问题。
因此，国内该领域的临床微生物专家就hvKP病原学、耐药性、实验室检测等方面达成初步共识，明确了hvKP临床检测的必要性，以及目前常用检测方法的技术特点、注意事项、生物安全要求、检测和结果解读等常见问题及应对策略，为临床应对和防控hvKP感染提供系统性的参考依据。
一、共识的形成过程
二、hvKP流行病学
hvKP是肺炎克雷伯菌的高毒力变种，具备高侵袭性和高致病性，可引发肝脓肿等侵袭性感染［1，4］。1986年，Liu等［5］在化脓性肝脓肿合并眼内炎和其他器官侵袭性感染的患者体内分离出hvKP。随后在欧美、非洲及澳大利亚等地陆续报道临床hvKP感染病例，但其流行性传播的国家仍主要集中在亚洲，包括中国、越南和韩国等［6］。
肺炎克雷伯菌是条件致病菌，可存在于皮肤、呼吸道和胃肠道等［1］，因此其存在和定植是必然的，但不一定会导致感染。hvKP可长期定植于健康人体内（健康人群定植率>10%）［7］。除定植外，hvKP感染病例在世界范围内的报告也越来越多，在细菌性肝脓肿中hvKP的检出率可高达40%~80%［8, 9］。自2010年来，我国hvKP感染病例的检出率逐年上升［10, 11］，调查发现，以检出气杆菌素毒力基因为hvKP判断标准，我国的检出率较高，总检出率为37.8%，且不同城市呈现地域差异性，武汉检出率最高，为73.9%，浙江检出率最低，为8.3%［12, 13］。Guo等［14］调查发现我国院内侵袭性感染分离的肺炎克雷伯菌中hvKP高达22.8%。除我国外，亚洲其他国家如新加坡、韩国、马来西亚等地hvKP感染率也较高，而欧美等西方国家的感染率则相对较低［2］。
三、hvKP病原学
不同于cKP主要来源院内感染，hvKP大多分离自社区获得性感染患者［9，15］，能引起肝脓肿、肺炎及脑膜炎等多部位侵袭性感染，通常进展迅速，预后差，且病死率极高，是威胁人类健康的重要病原菌［1，4］。
（一）hvKP的毒力因子
hvKP的毒力因子包括荚膜、脂多糖、菌毛、铁载体、外膜蛋白和6型分泌系统（type 6 secretory system，T6SS）等［4，15］，其中荚膜和铁载体是hvKP毒力的主导因素［16］。
1. 荚膜（K抗原）：临床研究证实，高黏液性的肺炎克雷伯菌更容易引起肝脓肿、化脓性脑膜炎等侵袭性感染，且其毒力明显增强［17］。而这种高黏液性与其荚膜关系密切，荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）在病原体的最外层［18］，主要通过充当物理屏障来抵抗多形核细胞的吞噬作用。hvKP的荚膜抗原（K抗原）也是其毒力增强的重要因素［19］。根据K抗原不同至少可将肺炎克雷伯菌分成82个血清型，也是常用的hvKP分子分型方法。在血清荚膜分型中，K1和K2是hvKP的主要型别［18］，其他型别K5、K16、K20、K54、K57和 KN1等也有报道［15］。荚膜相关的黏液表型由位于hvKP染色体及质粒上的rmpA、rmpA2和magA基因调节［1］，rmpA是一种转录激活因子，可以激活细菌荚膜的产生；magA又名wzykDk，是黏液相关基因，与超级荚膜的形成相关，为K1型hvKP特有［8］。
2. 脂多糖（O抗原）：脂多糖由脂质A、核心寡糖和可变O-抗原多糖侧链组成，有较强的免疫原性，其中O侧链可帮助细菌逃避补体介导的免疫杀伤作用［19］。根据O抗原不同，现已发现肺炎克雷伯菌有9种血清型，其中O1型与肝脓肿的hvKP关系密切［20］。与脂多糖相关的基因包括uge基因和wabG基因。其中uge基因存在于绝大多数肺炎克雷伯菌株中，表达光滑型脂多糖，致病力强。wabG基因存在于大部分临床分离菌中，能使肺炎克雷伯菌合成脂多糖外柱，从而使毒性增强［4］。
3. 菌毛：菌毛能帮助细菌黏附定植在上皮细胞，是细菌入侵机体的前提，也是增强细菌致病性的重要因素［2］。Ⅰ型菌毛有FimA和FimH两个亚基，由fim基因簇编码。FimH位于菌毛尖端，能够与上皮细胞的D甘露糖糖蛋白结合而黏附定植。Ⅰ型菌毛在hvKP引起的泌尿系感染中发挥重要作用。Ⅲ型菌毛为螺旋状结构，有MrkA亚基和MrkD黏附蛋白，主要的编码基因是mrkABCDF。Ⅲ型菌毛在hvKP生物膜形成中的作用比Ⅰ型菌毛更强，与留置导尿管、引流管相关的感染关系密切［4］。
4. 铁载体：铁既是细菌赖以生存和繁殖的重要营养素，也是许多致病菌的重要毒力因子［21］。细菌在缺铁的条件下会分泌一种低分子量的铁螯合剂，即铁载体［22］。在肺炎克雷伯菌中，吸收铁的主要机制就是通过产生铁载体形成铁-铁载体复合物，辅助细菌从外环境中摄取铁元素，从而促进病原菌分裂繁殖［4］。因此较高的摄铁能力可介导细菌毒力增强，与hvKP毒力密切相关的铁载体主要包括沙门菌素、气杆菌素、肠杆菌素和耶尔森菌素［21］。
沙门菌素由iroBCDN基因编码，是邻二苯酚盐型铁载体蛋白，通过加快细菌复制造成感染扩散，从而加重感染［23］。肝脓肿相关的hvKP分离株中90%都能分泌沙门菌素。气杆菌素由iucABCD-iutA基因簇编码，是以羟肟酸盐为基础的铁载体，能帮助细菌在缺铁环境中增加铁的总量，增强hvKP的毒力［23］。肠杆菌素由entABCDEF基因簇编码，也是邻二苯酚盐型铁载体蛋白，具有与血浆转铁蛋白结合而促进细菌生长繁殖的作用，还可以促进细菌生物膜的形成和成熟而增强细菌毒力［4］。耶尔森菌素由irp、ybt、fyu基因编码，主要功能基团是酚盐和羧酸盐，通过降低活性氧的产生，降低机体免疫细胞对细菌的杀伤能力，从而使hvKP毒力增强［24］。其中在hvKP中检出率最高的是iroB和iucA［21］。
5. 其他毒力因子：研究发现与hvKP毒力相关性较高的还有转运蛋白PEG-344等［25］。其编码基因peg-344 位于质粒上，编码内膜转运蛋白，产物是代谢物转运子超家族中的一种渗透酶［26］。近年来才陆续出现有关该标志物的报道［26, 27］，Liao等［27］发现PEG-344的诊断敏感度高达99%、特异度为96%、准确性为97%，为检测效能最高的指标。此外，还有PEG-1631（保守假定蛋白）、PEG-589（氨基葡萄糖内酯脱碳酶家族调节基因）等也可作为检测效能较高的hvKP毒力标志物［25］。
（二）hvKP的分子分型
1. 荚膜血清型：根据肺炎克雷伯菌特异性K抗原将其分为不同的荚膜血清型，也是常用的hvKP分子分型方法，详见上节“（一）hvKP的毒力因子”。
2. 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）：MLST是最常用于细菌分型的分子生物学方法，可用于分析菌株的基因型和同源性。肺炎克雷伯菌是一种具备地区性克隆流行特征的病原体，在欧美等地最常见的分型为ST258，在亚太地区最常见为ST11［28］。hvKP也有其特定的ST分型，以ST23、ST86和ST65为主，最常检出的是K1型ST23和K2型ST86［6，29］。迄今文献已经报道了不同地区MDR-hvKP至少51种不同ST型和13种血清型（K1、K2、K5、K16、K19、K20、K24、K47、K51、K54、K57、K62、K64、KL108）［8］，而其中我国报告的感染病例最多，涵盖至少38种不同的ST型和11种血清型，ST11和ST23型MDR-hvKP分离株最常见［6，30］。
（三）hvKP的耐药性
肺炎克雷伯菌是多重耐药细菌（multi-drug resistant bacteria，MDRB）中最常见的一种，其中碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant K. pneumoniae，CRKP）占比超过20%（www.chinets.com）。早期研究曾普遍认为高毒力与多重耐药性不会在同一株肺炎克雷伯菌上表达，即相对于cKP的高耐药率，hvKP多表现为对抗菌药物的高敏感性［6］。但近年来有关hvKP耐药菌株的报道越来越多，甚至不乏多重耐药（multiple-drug resistant，MDR）、泛耐药（extensively-drug resistant，XDR）甚至全耐药（pan-drug resistant，PDR）菌株，这给hvKP感染的临床治疗带来了极大困难，MDR-hvKP也成为了颇受临床关注的新兴“超级细菌”［8，31］。更严重的是，大多数MDR-hvKP的报道都来自亚洲，特别是我国［12］。我国分离自侵袭性感染的hvKP菌株中检出12.6%产超广谱β内酰胺酶（extended spectrum β-lactamase，ESBL），ST11型CRKP中高毒力株检出率约30%，远高于其他国家［6，12，32］。
在耐药机制上，hvKP与cKP一致，目前报道的与耐药hvKP相关的机制主要有：（1）头孢菌素类抗菌药物耐药：产生SHV-12、CTX-M等ESBL是肠杆菌目细菌对 β内酰胺类药物产生耐药的主要机制［33］。（2）碳青霉烯类抗菌药物耐药：肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是产生碳青霉烯酶，如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）、新德里金属β内酰胺酶1（New Delhi metal-β-lactamase 1，NDM-1）和OXA-48，此外产ESBL或高产AmpC酶和孔蛋白如 OMPK35/36突变的组合也可能使菌株产生碳青霉烯类耐药性。（3）多黏菌素、替加环素和头孢他啶-阿维巴坦耐药：多黏菌素和替加环素一直被认为是产生碳青霉烯酶（如KPC和NDM-1）革兰阴性菌所致感染治疗的最后一道防线，目前研究最广泛的是稳定、可转移的质粒上携带多黏菌素和替加环素耐药基因如mcr-1和tet（X）而表现为耐药［34］。新型抗菌药物头孢他啶-阿维巴坦在MDR感染中的疗效显著优于传统药物，可联合氨曲南作为产金属β内酰胺酶（metal β-lactamase，MBL）的CRKP首选治疗药物，但对产KPC变异体的CRKP菌株无效［35］。
四、hvKP实验室检测
（一）hvKP的分离培养
1. 样本采集、运送及注意事项：临床医师应根据患者临床症状及病灶特征，如出现以下高度怀疑hvKP感染的临床表现：（1）肝脓肿；（2）眼内炎；（3）血流感染；（4）脑膜炎、脾脓肿、骨髓炎和坏死性筋膜炎等，为此类患者开具普通细菌培养+KP毒力鉴定+药敏试验的申请单，并尽可能备注详细的临床信息，为实验室鉴定hvKP提供临床参考依据。另外，若未出现上述高危症状且未开具hvKP表型鉴定的申请单，而实验室在普通细菌培养中发现分离的肺炎克雷伯菌菌株黏液性较强或出现拉丝，建议及时与临床沟通，增开相应的申请单。
送检合适的样本种类，留取合格的、有高诊断价值的临床样本，建议采集病灶脓液、穿刺液等样本，非无菌样本注意排除正常菌群和定植菌的干扰；样本采集时间最好是病程早期或急性期，尽可能在抗菌药物使用前采集临床样本；若患者已使用抗菌药物，应在下一次使用抗菌药物前采集样本，并在申请单上注明使用的抗菌药物种类和名称。开展院感主动筛查时，主要采集肛拭子或粪便标本。
不同类型的临床样本的采集及送检要求可详细参考中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的行业标准《临床微生物学检验标本的采集和转运》（WS/T 640-2018），所有临床样本采集后都应尽快送检，最好在2 h内送达，部分样本量少的样本最好于采样后30 min内送达。
2. 常规镜检和分离培养：细菌的分离培养是细菌感染性疾病中病原学鉴定的金标准，所获菌株也是后续生化反应鉴定、体外药敏试验以及抗菌药物筛选等研究的重要基础。hvKP的样本镜检及培养后初步鉴定均与cKP一致。
直接显微镜检查：临床样本直接涂片、革兰染色、镜检，显微镜下为革兰阴性杆菌，可见明显荚膜。
分离培养：痰、咽拭子、肺泡灌洗液、胸腹腔积液、穿刺液等临床样本，按分区划线法接种于培养基上（可采用血琼脂平板和麦康凯或中国蓝等选择培养基），35 ℃、5%~10% CO2条件下常规培养18~24 h后，观察单个菌落形态：血琼脂平板上为大、黏稠、易融合成片的菌落，hvKP可为有拉丝的菌落；麦康凯上为粉红色黏稠的菌落，挑选可疑菌落进行进一步的菌种鉴定和体外药敏试验。血培养样本按照《血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识》中建议的流程操作［36］，报阳后转种、鉴定。
（二）hvKP鉴定
（三）体外药物敏感性试验
hvKP耐药性分析与常规cKP的方法一致，包括耐药表型的检测——纸片扩散法（K-B法），肉汤宏量稀释法、肉汤微量稀释法、琼脂稀释法、E-test法和自动化药敏系统。抗菌药物的选择和结果判定参照临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的抗菌药物选择原则和判断标准，具体操作方法和结果报告可参考第5版《临床微生物学检验》［46］，以及《全国临床检验操作规程》（第4版）。
明确hvKP菌株，若检出MDR、ESBL或CRKP，应在报告单上注明。
（四）hvKP检测流程
检测流程见表2和图1。
（五）结果报告
hvKP的检测报告应该按照以下流程出具。
第一，报告细菌种属鉴定结果——肺炎克雷伯菌。
第二，报告hvKP毒力表型结果——拉丝试验是否为阳性。
第三，报告hvKP毒力因子基因型结果——rmpA、rmpA2、iucA、iroB和peg344毒力基因是否为阳性及是否检出经典的毒力质粒pK2044 或pLVPK等，并备注局限性：仅用于科研。本条对实验室要求较高，要求实验室具备PCR操作平台；毒力质粒pK2044 或pLVPK的检测需要NGS测序数据分析，但NGS 目前主要用于科研，其临床大规模应用仍需进一步标准化和规范化。
第四，报告体外药敏试验结果——与常规肺炎克雷伯菌的药敏报告格式相同，报告常规药物体外药敏试验结果及ESBL、CRE产酶情况。
五、生物安全
六、总结
引用：中国老年医学学会检验医学分会, 上海市医学会检验医学专科分会, 上海市微生物学会临床微生物学专业委员会. 高毒力肺炎克雷伯菌实验室检测专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2023, 46(11): 1164-1172.
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