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特异性药物性肝损伤（DILI）是一种罕见的肝脏疾病，但有极高的发病率和死亡率。DILI是急性肝衰竭（ALF）的主要病因，肝移植后存活率低。在美国，特异性DILI占ALF的11%-18%。DILI的诊断具有挑战性，抗微生物药物是DILI最常见的药物之一。对DILI遗传风险因素的研究促进人类白细胞抗原（HLA）等位基因的鉴定，这些等位基因使患者易患DILI，继发于个体药物，包括抗生素。阿奇霉素（AZ）是一种半合成大环内酯类抗生素，广泛用于治疗和预防细菌感染。由于其口服生物利用度，广谱覆盖和每日一次给药，阿奇霉素是美国最常用的抗生素之一。2022年，阿奇霉素是美国门诊处方量第二大的抗生素，处方量为3490万张：每1000人中有105张处方。尽管总体上具有良好的安全性，但来自AZ的DILI（AZ-DILI）已被报道，主要为病例报告的形式和少数队列研究。在美国最近的一项研究中发现，AZ-DILI在每10,000名接触者中有4.36人发病。美国药物性肝损伤网络（DILIN）是一个建立于2003年的多中心研究网络，旨在提高对儿童和成人特异性DILI的临床特征、病因、发病机制和预后的认识。自2004年以来，DILIN前瞻性地纳入了药物、草药和膳食补充剂引起的肝损伤病例。本研究旨在通过扩大病例系列来更新AZ-DILI的临床特征和预后，并提供HLA在AZ-DILI患者中的作用的新信息。
DILIN前瞻性研究是一项正在美国六个中心进行的多中心观察性研究，其设计、纳入和排除标准已在前面详细说明。在损伤发生6个月内出现并符合预先确定的实验室标准的DILI疑似病例在临床研究地前瞻性地纳入DILIN。标准包括总胆红素≥2.5 mg/dL或国际正常化比率（INR）>1.5，以及谷丙或天冬氨酸转氨酶（ALT或AST）或碱性磷酸酶（ALP）水平升高；或者是ALT或AST高于正常值上限（ULN）的5倍或ALP连续两次测量间隔至少24小时高于正常值上限的2倍。一个标准化的方案被用于评估使用药物或草药和膳食补充剂与肝损伤之间的因果关系。根据专家共识意见将因果关系分为确定（>95%可能性）、极有可能（75%-95%）、很可能（50%-74%）、可能（25%-49%）或不太可能（<25%）。肝损伤模式用R值进行分类，其中R = [ALT/ULN ALT]÷[ALP/ULN ALP]；肝细胞性损伤被定义为R≥5，胆汁淤积性损伤≤2，在2和5之间为混合损伤。使用5分制来定义严重程度，范围从1（轻度，无黄疸），2（中度，黄疸），3（中度，住院），4（严重，有肝功能衰竭的证据）到5（发病6个月内因DILI死亡或肝移植）。慢性肝损伤定义为：（1）在基线肝酶正常或未知的患者中，血清AST、ALT、ALP、INR或总胆红素两次测量均升高；（2）肝脏DILI患者血清AST、ALT、ALP、INR或总胆红素两次测量均高于基线值1.25倍；（3）存在门静脉高压或肝性脑病；（4）任何持续肝损伤的组织学证据；（5）6个月内有任何慢性肝病的放射学证据。在6个月复查时符合慢性DILI标准的参与者在随后的12个月和24个月接受随访。在2004年至2022年期间纳入DILIN的具有高因果分数（明确，极可能或很可能）的AZ-DILI患者被纳入研究。回顾了这些患者的人口统计学、临床特征、肝损伤特征和临床预后。2013年5月之前在DILIN注册的个人资料可能已经被包括在以前的出版物中。可供审查的肝活检由DILIN专家肝组织病理学家（DEK）评估，并对临床信息不知情。使用Illumina MiSeq平台对DILIN的所有样本（包括AZ-DILI和其他DILI病例）进行HLA I类和II类基因测序。为了确定与AZ-DILI相关的HLA等位基因，本研究使用了独立的对照组，包括：(1)从5个基因型和表型数据库中收集的人群对照（n=15021）,(2)其他DILI病例（n=768）,(3)阿莫西林-克拉维酸DILI（AC-DILI）病例（n=239）。与其他DILI病例进行比较，包括继发于阿莫西林-克拉维酸的DILI病例，研究与AZ- DILI相关的遗传因素是该DILI独有的还是与其他DILI共有的。由于只有基因组范围的基因型数据可用于群体对照，因此基于6号染色体HLA区域的单核苷酸多态性（snp），使用带有属性套袋（HIBAG）程序的HLA基因型输入，为群体对照输入4位数的HLA等位基因。所有DILI病例和对照组的祖先是根据遗传相似性确定的，该基因型数据参考了前面描述的26个群体的1000个基因组（1KG）数据。分别计算非西班牙裔白人（NHW）子集和完整数据集的所有样本（所有DILI病例和人口对照）的主成分。使用Fisher精确检验独立比较AZ- DILI病例和各对照组之间HLA等位基因频率（AF）的差异。采用单变量logistic回归来检验年龄、性别和各主成分对AZ-DILI风险的影响。采用多变量logistic回归分析检验HLA等位基因与AZ- DILI的相关性，并对单变量分析中选择的两个协变量进行调整。通过将病例与每个对照组进行比较，分别对NHW子集和完整数据集进行关联分析。利用单倍型对感兴趣的HLA等位基因进行单倍型关联检测。Cobygram程序用于可视化各组间的单倍型频率。为了纠正多重测试，使用q值R包计算q值，这是一种错误发现率方法。HLA等位基因和单倍型的q值＜0.15被认为是显著的。所有患者均提供书面知情同意书。研究方案的所有细节均由各试验点的机构审查委员会审查和批准。
2004年至2022年期间，有1635起DILI案件被纳入DILIN，并作为高可信度案件进行裁决。30例高因果性AZ-DILI被确定并纳入研究，包括4例明确病例、14例极可能病例和12例很可能病例（表1）。中位年龄为46岁（范围1-78岁）。其中60%为女性，83%为NHW血统。5例患者先前存在肝脏疾病，包括酒精相关肝病（ArLD）（n=1）、代谢功能障碍相关脂肪变性肝病（MASLD）（n=2）、肝酶异常（n=1）和先天性肝脏胆道闭锁（n=1）。其他重要的并发症包括乳糜泻（n=1）和糖尿病（n=4）。阿奇霉素治疗的中位持续时间为5天（范围2-8天），中位潜伏期为18.5天（范围2-65天）。最常见的症状是黄疸（n=22,73%）、腹痛（n=19, 63%）和恶心（n=18, 60%）。其他体征和症状包括瘙痒（n=13, 43%）、发热（n=7, 23%）和皮疹（n=7, 23%）。肝损伤分型中：肝细胞型占60%（18例），胆汁淤积型占27%（8例），混合型占3%（1例）。有三种情况没有记录初始R值。发病和峰值水平的实验室结果中位数如表1所示。DILI发病至ALT、ALP和胆红素峰值的中位时间分别为2天（范围0-415天）、4天（范围0-625天）和8天（范围0-625天）。血清ALT和ALP水平低于正常上限的中位时间分别为66天（4-1572天）和136天（16-775天）。血清胆红素水平从峰值水平恢复到＜2.5 mg/dL的中位时间为28天（范围2-264天）。
2例患者需要肝移植。有1例与肝脏相关的死亡，发生在一名潜在的ArLD患者身上。5例（17%）发生慢性肝损伤；其中80%的人在肝损伤开始时有肝细胞酶损伤。17例进行肝活检，从肝损伤开始到活检的中位时间为38天（范围2-531天）。14名受试者的肝脏标本可用于中心综述。表2总结了13例患者的初始活检组织学结果。在这13例患者中，9例患者的病理以及14例患者的外植体在我们之前的文章中有详细的回顾。没有浆细胞增加的病例，但13例中有4例嗜酸性粒细胞增加。本文新报道的4例患者中，2例出现急性肝炎，2例出现胆汁淤积性肝损伤。急性肝炎和胆汁淤积性肝损伤（从轻度炎症的急性（轻度）胆汁淤积到胆汁淤积性肝炎再到慢性胆汁淤积）是本队列中两种主要的损伤模式。虽然在之前的报告中发现了静脉闭塞性改变，但目前的病例中没有一例出现这种改变。其中2例发展为慢性损伤。病例4持续碱性磷酸酶升高，发病一年后活检显示小管扩张伴小胆管血栓，但无纤维化炎症。病例6最初为急性肝炎伴区域性坏死，但随后的两次活检显示发展为坏死后肝硬化。除了两份活组织检查外，其余都符合药物损伤。病例11有肝硬化，可能与酒精有关。病例12有与干细胞移植相关的改变。可能只有慢性胆汁淤积性损伤与AZ有关。
7例患者（23%）接受皮质类固醇治疗。在这一队列中，6例有肝细胞性肝损伤；1例SMA阳性；1例ANA阳性；1例IgG水平大于1600 mg/dL。6例接受皮质类固醇治疗的患者行肝活检；2例有自身免疫性肝炎（AIH）特征。这2例药物诱导的自身免疫性肝炎（DI-ALH）是仅有的经皮质类固醇治疗后改善肝酶的病例。1例患者随后用硫唑嘌呤治疗，2年后停用。通过常规随访，他们的肝酶保持正常。没有患者被诊断为新发特发性AIH。5名患有AZ-DILI的儿童被纳入队列（17%）。儿童队列的患者特征和临床特征见表3。阿奇霉素治疗的主要适应症是上呼吸道感染。三名儿童住院，一名需要肝移植。1名儿童出现了严重的皮肤反应（史蒂文斯-约翰逊综合征），两名儿童出现慢性肝损伤。一种是发病时的肝细胞性肝损伤，以前曾描述过，发生在一名患有史蒂文斯-约翰逊综合征和呼吸系统并发症的患者身上，需要多次住院。在此期间，肝酶持续升高，三次肝活检显示肝损伤进展。该患儿在DILI发病约22个月后死于非肝脏相关原因。这是儿科队列中唯一的死亡病例。尸检显示肝脏肿大，伴有广泛的大泡性脂肪变性，胆汁淤积伴胆管增生，早期桥性纤维化。另一慢性肝损伤是发病时出现的胆汁淤积性肝损伤，ALP持续升高（399 IU/L），在DILI发病后1年多的随访中，超声显示肝脏回声增强。
表3 阿奇霉素引起的儿童肝损伤的患者特征和临床特征
在29例具有HLA测序和全基因组基因分型数据的高度怀疑的AZ-DILI病例中；21人是NHW血统，2人是非洲血统，3人是西班牙血统，3人是东亚血统。HLA-DQA1*03:01在AZ-DILI人群中与NHW人群对照（AF:0.29 vs. 0.11, p=0.001）和AC-DILI人群对照（vs.0.11, p=0.002；表4）。与其他药物引起的DILI相比，HLA-DQA1*03:01没有明显过代表。多变量logistic回归分析结果显示，HLA- DQA1*03:01与人群对照相比，AZ- DILI发生风险增加（OR [95% CI] = 3.44 [1.73, 6.47]，p=0.001），AC-DILI患者（OR [95% CI] = 3.62 [1.63, 8.13]，p=0.002；表5）。AZ-DILI病例中其他祖先群体均未携带DQA1*03:01等位基因。另外几个HLA等位基因在AZ-DILI和AC-DILI患者中存在显著差异。HLA-A*01:01、HLA-DQB1*03:02和HLA-DRB1*04:01在AZ-DILI患者中比AC-DILI患者更普遍，而DQA1*01:02和HLA-DRB1*15:01在AZ-DILI患者中较不普遍（表4）。在两种分析中调整主成分1和主成分2（表5）和所有受试者后，这些差异仍然存在。特别是，HLA-DRB1*04:01，一种已知的自身免疫相关等位基因，在AZ-DILI病例中的发现率比AC-DILI病例高3倍（AF: 0.17 vs 0.06,p=0.017）（表4），并且在NHW中AZ-DILI的风险显著高于AC-DILI病例（OR [95% CI]=3.39 [1.27, 8.60]，p=0.017；表5）和所有受试者（OR [95% CI]= 2.96 [1.14, 7.11]，p=0.027）。由于已知DRB1*04与DQA1*03:01在同一单倍型上，所有携带DQA1*03:01的12例AZ-DILI NHW病例也携带DRB1*04等位基因，其中7例为DRB1*04:01携带者。当DQA1*03:01和DRB1*04:01联合建模时，DQA1*03:01仍然显著（例如，与对照组相比p=0.004），但DRB1*04:01不显著。利用HLA- DQA1*03:01和DRB1*15:01的关联信号，探讨了已知单倍型DQA1*03:01—DQB1*03:02 (DQ8单倍型的一个亚型)和DRB1*15:01—DQA1*01:02—DQB1*06:02与AZ-DILI的关联。NHW地区AZ-DILI病例中DQ8单倍型比AC-DILI病例更普遍（单倍型频率：0.17 vs 0.05, p=0.0017）。另一方面，DRB1*15:01—DQA1*01:02—DQB1*06:02单倍型在AZ-DILI病例中的患病率显著低于NHW AC-DILI病例(haplo-freq：0.12 vs 0.31, p=0.007)。
比较NHW内DQA1*03:01携带者（n=12）与非携带者（n=9）的患者特征、临床特征和临床结局。慢性DILI的发生是两组间唯一具有统计学意义的因素（携带者0 vs非携带者57%）。
表4 HLA等位基因在符合q值<0.15的非西班牙裔白人（NHW）受试者的病例和对照组之间显示显著的等位基因频率差异
表5 非西班牙裔白人（NHW）受试者调整PC1和PC2 q值<0.15后的logistic回归模型结果
本研究中检查的30例阿奇霉素引起的高因果性肝损伤病例占2004年至2022年DILIN登记的成人高因果性DILI病例的2%和儿科高因果性DILI病例的7%。本研究强调肝细胞损伤和患者年龄小与显著的发病率和死亡率相关。尽管使用时间较短，但有4例患者肝活检出现严重坏死，以3区为主。4例患者均为肝细胞型损伤，1例需要肝移植，2例发展为慢性肝损伤。DILI是一种罕见且未得到充分认识的儿科肝病病因，小儿DILI约占所有DILI病例的10%，然而，我们研究中的5例儿科病例在我们整个AZ-DILI队列中所占的比例更高（17%）。该队列中出现的并发症包括住院、严重皮肤反应、肝移植和慢性肝损伤。所有儿科处方医师和药剂师都有必要提高对阿奇霉素在儿童中引起的肝损伤相关发病率的认识，特别是考虑到阿奇霉素广泛用于儿童上呼吸道感染。HLA分析显示HLA-DQA1*03:01是发生AZ-DILI的潜在危险因素，AZ-DILI人群的AF比对照组高近2.6倍。在NHW DILI病例中，与非携带者相比，DQA1*03:01的存在对慢性肝损伤的发展具有保护作用；然而，需要进一步验证这种关系。与AC-DILI病例相比，我们检测到该等位基因与AZ-DILI之间存在显著关联，这表明DQA1*03:01在AC-DILI中不起作用。当我们将DQA1*03:01扩展到DQ8单倍型（DQA1*03:01—DQB1*03:02）时，与其他DILI病例和对照组相比，DQ8单倍型在AZ-DILI中更为普遍，这表明DQ8单倍型可能对AZ-DILI更具特异性，并且可能比单独DQA1*03:01更好地预防AZ-DILI的发生。另有5个HLA等位基因在AZ-DILI中与AC-DILI中存在显著差异，其中3个等位基因在AZ-DILI中富集程度更高（A*01:01, DQB1*03:02, DRB1*04:01）。DRB1*04:01是已知的与AIH相关的HLA等位基因，但AZ-DILI患者均未发现合并AIH。DRB1*04:01在AZ-DILI中比在AC-DILI中更有可能是由于它与同一单倍型上的DQA1*03:01的关系。需要进一步调查以确定这些等位基因对AZ-DILI比AC-DILI更显著的临床原因和风险或保护作用。DQA1与多种自身免疫性疾病相关，包括乳糜泻和1型DM。乳糜泻和1型DM的遗传学已经确定，DQ8单倍型（DQA1*03:01—DQB1*03:02）是一个危险因素。有趣的是，II类单倍型HLA- DRB1*15:01—DQA1*01:02—DQB1*06:02是AC- DILI的一个危险因子，它对I型DM和含有HLA- DQB1*06:02的单倍型具有保护作用，即使在携带HLA-DQA1*03:01的个体中也是如此。我们的数据支持DRB1*15:01—DQA1*01:02—DQB1*06:02单倍型对AZ-DILI的保护作用优于AC-DILI。HLA-DQA1*03:01也可能与确定的eb病毒免疫应答和对特定肿瘤的保护有关，需要进一步的研究来评估AZ-DILI和DQA1-相关疾病与其他潜在风险因素（如对常见流行病毒的免疫反应）之间的关系。在此之前，认识HLA分子分型在乳糜泻中的作用有助于了解其在DILI中的意义。HLA分子分型是一种阴性预测值（NPV）的基因检测。在临床实践中，HLA的作用是筛查乳糜泻的一级亲属，并在诊断不明确的病例中作为附加检测。建议使用HLA数据作为生物标志物进行遗传风险评估，以确定开始特定药物治疗前DILI的风险或易感性。在临床实践中，使用阿巴卡韦前进行HLA-B*57:01筛选，阿巴卡韦是一种用于HIV的核苷逆转录酶抑制剂，因为理想筛选试验所需的100% NPV和高阳性预测值（PPV）使得该试验可行且具有收益。然而，大多数其他药物，包括抗微生物药物，如氟氯西林，也与HLA-B*57:01相关，PPV小于1%，NPV明显小于100%。荷兰药物遗传学工作组在荷兰开展的一项全国性研究还表明，除阿巴卡韦外，在用药前对HLA等位基因进行基因分型对大多数药物都没有成本效益。然而，随着我们在更广泛的人群中了解HLA对更广泛的药物诱导疾病的风险，我们将对此有更深入的了解。HLA在了解DILI和其他药物性疾病的免疫发病机制方面发挥了明确的作用。HLA可能在未来的诊断中发挥更大的作用，特别是在可能涉及多种药物的情况下。与乳糜泻的基因分型相似，HLA分子分型在可能存在AZ-DILI的情况下，当多种药物涉及肝损伤时，将增加DILI诊断的准确性；需要注意的是，阴性检测不能排除诊断。此外，它可能有助于识别有风险的亲属，从而预防未来可能导致发病率和死亡率的肝损伤。
AZ-DILI可在成人和儿童中导致较高的发病率和死亡率。肝细胞损伤类型和儿童发病与较差的预后相关。HLA-DQA1*03:01可能是AZ-DILI的危险因素，因为其AF高于对照组和AC-DILI病例，但它并非仅针对AZ-DILI。结果表明，DQ8单倍型（DQA1*03:01—DQB1*03:02）可作为鉴别AZ-DILI与其他DILI的较好危险因子。HLA-DQA1*03:01和DQ8单倍型在AZ和其他DILI中的作用机制需要进一步的验证和研究，并探讨它们在临床实践中的作用。
Conlon C, Li YJ, Ahmad J, et al. Clinical characteristics and HLA associations of azithromycin-induced liver injury. Aliment Pharmacol Ther. 2024;60(6):787-795. doi:10.1111/apt.18160
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